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当前位置: 首页 > 在线留言 > 求大神帮助,关于我的过表达载体用pEGFP-N1质粒构建转染细胞的问题
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  • question 细胞转染,有两个问题想问下贴吧里面的大神:

    1、目的基因融合了gfp蛋白后对目的基因后续的功能有没有影响?因为我要做通路,目的蛋白是我检测下游基因和蛋白重要的保障。但我看了很多文献,貌似都是用的目的蛋白-gfp重组载体做的转染然后检测?所以我想问下,目的蛋白融合了gfp后会不会使得目的蛋白的功能改变或者直接失效?因为我的目的蛋白插入位点在gfp之前,如果有影响,我需不需要在目的蛋白的下游引物添加终止密码子不让gfp表达?如果按照这样做了,但是后面做转染的分组我是过表达组,空载组和空白组,过表达组没有gfp蛋白而空载组有gfp蛋白?岂不是实验不够严谨?好矛盾啊,到底转染的质粒用融合蛋白的好还是单独表达目的蛋白的号?

    2、第一次在这个原代细胞上做,摸索转染效率是用gfp空载来摸索好还是用目的蛋白融合gfp质粒来摸索好?

    ">求大神帮助,关于我的过表达载体用pEGFP-N1质粒构建转染细胞的问题

    • answer

      1.据我了解的,目的蛋白融合了GFP不会使得其功能改变吧,它只是一个绿色荧光蛋白,你要是有这方面担忧的话,病毒构建包被之前就可以选择不带荧光的病毒质粒,对照组也不带。

      2.转染效率的摸索一个是通过GFP,可以比较直观的证明基因转入细胞,有相关的荧光图片,其实另一个也可以通过PCR、WB等这些间接证实基因转入细胞。最关键的,转染效率要结合病毒本身+细胞类型+细胞状态+操作等综合决定的,有些原代细胞本身就不好被转染,一转染死亡率很高,有些细胞需要耗费大量病毒才能转进去。

    • answer
      jassom
      目的蛋白基因+2A+GFP基因 这个序列插入你的载体,把载体用lipo转进细胞,它会表达2种蛋白,1是你的目的蛋白,2是GFP蛋白,二者是分开的。跑WB你只需目的蛋白条带

      加两个A,是指丙氨酸?这就能两个蛋白质分开了?需要添加IRES序列才能分开成两个蛋白质吧

    • answer

      楼主你做好了吗,请问楼主用的是什么试剂呀,这个【汉恒无缝克隆试剂盒】好用吗我准备用一下,不知道好不好用

    • answer 目的蛋白基因+2A+GFP基因 这个序列插入你的载体,把载体用lipo转进细胞,它会表达2种蛋白,1是你的目的蛋白,2是GFP蛋白,二者是分开的。跑WB你只需目的蛋白条带
    • answer

      那请问楼上二位,如果我是融合gfp蛋白,在做wb的时候,是不是我的蛋白分子量要加上gfp蛋白的分子量,在切胶的时候位置要比原来目的蛋白的位置要偏大点儿?

    • answer

      蛋白和GFP之间加个2A,它们的功能不影响

    • answer

      是分开的。建议楼主多看看文献

    • 收起
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